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柠檬酸的发酵因、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。微生物生成柠檬酸要求低pH，适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

柠檬酸发酵要求较强的通风条件，柠檬酸厂家，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而*了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用，过量的金属离子引起产酸率的降低，由于铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。

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1923年美国菲泽公司建造了世界上家以黑曲霉浅柠檬酸粉盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、 德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。这样，依靠从柑橘中提取天然柠檬酸的方法逐渐为发酵柠檬酸所取代。1950年前，柠檬酸采用浅盘发酵法生产。1952年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。