杂交瘤细胞的筛选与克0隆
细胞融合后,培养于添加了 HAT 的选择培养基的 96 孔板中,培养一天后半定量换液,培养基更换时应注意轻缓,第 5 天能在显微镜下看到明显的杂交瘤细胞克0隆,第 7 天左右,杂交瘤细胞能长至铺满孔底约 1 /10。此时进行 ELISA 检测养心细胞孔。取细胞培养上清对 MRJ 融合蛋白进行间接 Elisa检测,筛选出能分泌*0体的杂交瘤细胞孔,有限稀释法对阳性孔进行亚克0隆,经过 3 次亚克0隆后,获得了能够稳定 分 泌 * MRJ 融合蛋白单克0隆*0体的细胞株。对杂交瘤细胞株按从 96 孔板-24 孔板-10 cm 培养皿的顺序扩大培养,部分细胞用于腹0水制备单*,部分细胞冻存备用。
饲养层细胞制备
于细胞融合*天,准备饲养层细胞,常选用小鼠腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是: 一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死0亡的细胞和细胞碎片,8周标准兔多*制备佐剂,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的数目应适宜,过少则不能提供杂交瘤细胞所需要的生长因子,过多会阻碍杂交瘤细胞的贴壁,一般以铺满孔底 30% 为好。
腹0水的纯化
采集复水后,12 000 r/min 离心 15 min,去掉 沉淀等杂质。往离心后的腹0水中加入等体积的 PBS,并添加*铵固体至 50% 饱和,静置 2 h,12 000 r/min离心15 min,弃 上 清,用 PBS 重 新 溶 解 沉 淀,然 后 再次加入*铵固体至 45% 饱和,静置两个小时左右,12 000 r/min 离心 15 min 弃去上清,用少量 PBS 溶解沉淀,即得到较纯的*0体,对 PBS 透析除去*铵,透析时间为24 h,透析过程中更换透析液两至三次。