微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚本乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的,非离子型洗涤剂既含疏水基团,也含亲水基团,其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合,从而削弱蛋白质与固相载体的结合,并借助于亲水基团和水分子的结合作用,使蛋白质回复到水溶液状态,从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20,其浓度可在0.05%-0.2%之间,高于0.2%时,可使包被在固相上的*原或*1体解吸附而减低试验的灵敏度。
细胞裂解液
1) 吸去培养板内的培养基,用胰酶消化细胞,加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。
2) 收集细胞悬液,1000×g离心10min,兔elisa*盒,弃去培养基,用预冷的PBS润洗3次。
3) 加入适量的预冷PBS或细胞裂解液(临用前加入蛋白酶抑1制剂)重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。
4) 将样品放入-20℃或-80℃,使样品冷冻,再放室温解冻样品,反复冻融几次,使细胞充分裂解。也可将样品进行超声*碎,以达到裂解的目的。
5) 4℃10000×g 离心10min,除去细胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
4.注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下,所要标记的*1体也要活性****价高(****1低1∶16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,****活性好的首要条件。" i! t$ {2 f0 g8 |
2. 所使用*的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用*,****1好(或必需)新鲜配制。如在戊二1醛标记法中所用戊二1醛应为新鲜纯品,因戊二1醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。3 e0 t3 r9 d/ K H9 O; J l
3. 室温搅拌时须避光,室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前,须认真检查,****漏液。
4. 浓的标记物相当稳定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。