小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞，其中约有 2×104个是精原gan细胞，仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%，精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清终止消化，细胞实验外包公司，用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液，细胞实验外包选哪家，30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞，再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(CD90.2)阳性CD117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来，并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%，细胞实验外包，CD90.2阳性细胞占28.98±4.51%， 二者都阳性细胞占8.98±2.98%，CD117阴性CD90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 CD117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%，CD90.2阳性细胞占56.98±4.51%，二者都阳性细胞占 8.20±3.98%，CD117阴性CD90.2阳性细胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无显著性(Pgt;0.1)，CD90.2阳性细胞和CD117阴性和CD90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有显著性 (Plt;0.05);采用CD117和CD90.2作为标志分子，percoll离心后细胞悬液经FACS分选后获得细胞纯度

平板克l隆形成实验基本步骤::

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37预温培养液的皿中，并轻轻转动，宁夏细胞实验，使细胞分散均匀。置37团5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。

3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%*固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10~30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的数。后计算形成率。形成率= (数/接种细胞数) x100%平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。平板形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞- -定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

自噬流检测

自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的话化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病，特别是、*退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关，目前对于自噬液的检别是自噬与其相关疾病研究领域的热点。由于自噬流是一个曲多个步骤组成的动态过程。因此往需要精细的突验才能准确判断自啦流状态。