（1)引物长度：由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。

(2)溶解温度(Tm)：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算：Tm＝2(A T) 4(G C)。

需注意PCR反应至少有两个(一对)引物，两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近，*扩增仪，不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配，而引物Tm值较低，反应温度较高时则可能不能发生作用，*扩增仪，因此如引物的Tm值差异较大，*扩增仪厂家，可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。

(3)引物序列互补：设计引物时应绝l对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。

(4)3’-末端序列：为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。

PCR仪如今在我们的生活中应用的是很广泛的，而PCR仪有着不同的种类，其中一种就是荧光定量PCR仪，下面就跟随君意生物的小编一起来了解一下如何使用荧光定量PCR仪：

荧光定量PCR仪软件使用

反应板设置指南软件使实验设计非常简单，*扩增仪价格，包括复杂的多色荧光实验；

实时监测扩增曲线；

实验过程中可以增加PCR循环数；

自动设置荧光基线，自动计算荧光阈值使数据分析大大简化；

采用标准曲线进行靶*的绝l对定量；

*表达相对定量软件提供强大的结果分析显示，可以自动将多达10块96孔板*表达实验数据同时分析，并自动去除无关项数据；

自动SNP分析软件可以简单直观的图表输出分型结果并自动进行分型质量评分；

解离曲线数据采集操作简单，观察方便，可以在仪器运行时观察解离曲线数据；

观察实时扩增曲线时可以非常方便的标定所对应的样品孔位置；

光源使用时间监测及仪器系统自我诊断程序。