mRNA切割酶-友名生物技术

核酸酶污染的过夜鉴定

　　所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的*大酶单位数。

核酸外切酶污染鉴定

　　所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。

限制酶分布区域

限制性核酸内切酶分布*广，几乎在所有*的属、种中都发现至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆1菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。有的菌株含酶量*低，很难分离定性；然而在有的菌株中，酶含量*高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高产酶菌株。据报道从10g的H. aegyptius的细胞中，能分离提纯出可消化l0gλ噬菌体DNA的酶量。*是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。

质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质

如今，质粒载体中限制酶切位点的种类*为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ部分片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可1比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，mRNA切割酶，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克1隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：

1）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接头或衔接头。

2）在得到控制的反应条件下，用大肠杆1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平的反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低