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（1)引物长度：由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。

(2)溶解温度(Tm)：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算：Tm＝2(A T) 4(G C)。

需注意PCR反应至少有两个(一对)引物，两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近，不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配，而引物Tm值较低，反应温度较高时则可能不能发生作用，因此如引物的Tm值差异较大，可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。

(3)引物序列互补：设计引物时应绝l对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，pcr*扩增仪，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。

(4)3’-末端序列：为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。

梯度PCR仪是PCR仪的一种，*扩增仪，如今梯度PCR仪更多的应用于科研、教学机构。君意生物的小编就和大家一起来了解一下梯度PCR仪：

一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNApian段其****适合的退火温度不同，*扩增仪，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的****适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，*扩增仪厂家，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有****的加热控温探头，2009年为止只有美****BI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。

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